Die Gentechnik hat in den letzten beiden Jahrzehnten die Biotechnik innovativ weiterentwickelt. In einigen Wirtschaftsbereichen, wie z.B. Pharma und Chemie, werden gentechnische Verfahren in der Produktion bereits erfolgreich eingesetzt. Weltweit findet die Gentechnik gegenwärtig in zunehmendem Maße Eingang in die Lebensmittel- und Agrarproduktion. Nach allen Schätzungen wird sie hier ihr größtes Anwendungsgebiet finden, aber gerade in der Bundesrepublik Deutschland wird kaum ein Thema so kontrovers diskutiert wie der Einsatz der Gentechnik im Ernährungsbereich.
Zur Zeit sind weder in der Bundesrepublik Deutschland noch in der Europäischen Union Lebensmittel auf dem Markt, die den lebenden gentechnisch veränderten Organismus darstellen oder lebende gentechnisch veränderte Organismen (GVO) enthalten. In den USA, in Kanada und Japan dagegen sind solche Produkte zugelassen. Teilweise werden sie bereits vermarktet. Es ist abzusehen, daß weitere derartige Erzeugnisse auf dem Markt erscheinen, da eine Reihe von Zulassungsverfahren, unter anderem auch in der Europäischen Union, anhängig sind.
Verbraucher haben ein großes Informationsbedürfnis
und das Recht zu erfahren, wie ihre Lebensmittel hergestellt werden und was
sie enthalten. Verbraucher erwarten und fordern deshalb, daß unter
Einsatz der Gentechnik hergestellte Lebensmittel und Lebensmittelzutaten
umfassend gekennzeichnet werden. In der Diskussion zum Inverkehrbringen
gentechnisch modifizierter Lebensmittel und Lebensmittelzutaten stehen
Kennzeichnungspflicht und Nachweis im Vordergrund. Die Novel Food Verordnung,
die am 15. Mai 1997 in Kraft trat [ 1 ] und direkt in nationales Recht überging,
regelt in der Europäischen Union das Inverkehrbringen neuartiger
Lebensmittel und Lebensmittelzutaten. Sie schreibt für Erzeugnisse, die
vermehrungsfähige, gentechnisch veränderte Organismen (GVO)
enthalten oder aus solchen bestehen, und für Erzeugnisse, deren
Zusammensetzung, Nährwert oder Verwendungszweck nicht mehr gleichwertig
mit vergleichbaren, konventionell hergestellten Produkten sind, eine
Kennzeichnung vor. Der Nachweis, daß im Herstellungsprozeß eines
Lebensmittels oder einer Lebensmittelzutat gentechnische Verfahren eingesetzt
wurden, hat damit große Bedeutung erlangt.
3.2 Ansatzpunkte für ein Nachweisverfahren
Durch die gentechnische Modifikation unterscheidet sich der neue Organismus in mindestens einer Eigenschaft vom ursprünglichen Organismus. Dieser Unterschied kann prinzipiell zur Identifikation von Rohstoffen, Lebensmitteln und Lebensmittelzutaten herangezogen werden. Die gentechnische Modifizierung kann mit einer Veränderung des Phänotyps des Organismus verbunden sein (z.B. Form, Farbe, Resistenz), die als Grundlage für einen Nachweis dienen kann. Ein Nachweis läßt sich auch aufbauen, indem das neue direkte Genprodukt (Protein) oder das neues Stoffwechselprodukt identifiziert wird. Voraussetzung für einen erfolgreichen Nachweis über die Veränderung des Phänotyps oder über neue Substanzen ist die konstitutive, d.h. ständig ausgeprägte Eigenschaftsänderung aufgrund des gentechnischen Eingriffs. Im Gegensatz dazu ist der Nachweis einer Veränderung auf der Ebene des Erbmaterials (DNA-Ebene) unabhängig von der Ausprägung der gentechnischen Modifizierung. Der Nachweis setzt hier direkt auf der Stufe an, auf der die gentechnische Veränderung durchgeführt wurde. Nachweisverfahren müssen nicht unbedingt an der gewünschten Eigenschafts- bzw. DNA-Veränderung ansetzen (direkte Methode). Zum Nachweis können auch andere leicht erkennbare Eigenschaftsveränderungen oder Nukleotidsequenzen dienen, die zusammen mit der gewünschten neuen Eigenschaft oder dem erwünschten Fremdgen als Marker in den Empfängerorganismus eingebracht wurden (indirekte Methode).
Nach dem Gentechnikgesetz liegt eine gentechnische
Modifizierung vor, wenn genetisches Material auf eine Weise verändert
wurde, die unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder Rekombination
nicht vorkommt. Eigenschafts- bzw. DNA-Sequenzveränderungen erlauben aber
keinen unmittelbaren Rückschluß auf das Ereignis, das zu dieser Veränderung
geführt hat. Ziel einer Nachweismethode ist folglich nicht die Ermittlung
von Eigenschafts- bzw. DNA-Veränderungen, sondern die spezifische
Ermittlung von Eigenschafts- bzw. DNA-Veränderungen, die durch
gentechnische Verfahren erzielt wurden. Eine Unterscheidung zwischen Veränderungen,
die durch gentechnische Methoden erzielt wurden, und jenen, die auch mit
anderen Verfahren erzielt werden oder natürlicherweise auftreten können,
kann nur aufgrund von Indizien getroffen werden. Die Auswahl der
nachzuweisenden Veränderung oder des Nachweisverfahrens muß so
erfolgen, daß die Wahrscheinlichkeit, die Veränderung könnte
anders als durch Gentechnik erreicht worden sein, minimiert wird. Auch ein
negativer Befund kann nicht als Beweis dafür angesehen werden, daß
im Erbgut des untersuchten Materials keine gentechnisch bedingte Veränderung
vorliegt.
3.3 Nachweis über eine Veränderung des Phänotyps
Die gentechnische Veränderung eines Organismus kann zu einer Veränderung seines Phänotyps, der Erscheinungsform, führen. Dies kann als Grundlage für ein Nachweisverfahren dienen. Hierzu lassen sich vor allem diejenigen Änderungen im Phänotyp einsetzen, die durch Einbringen von Markergenen in den Empfängerorganismus ausgelöst werden. Markergene werden zusammen mit dem erwünschten Fremdgen in den Empfängerorganismus eingebracht, um gentechnisch veränderte Organismen leicht erkennen zu können. Der phänotypische Nachweis kann über selektive Charakteristika (Resistenzen gegen Antibiotika oder Herbizide, sowie Verwertung ungewöhnlicher Substrate) oder elektive Charakteristika (chromogene Markersysteme wie Katechol-2,3-dioxygenase, Galaktosidase, fluorogene Markersysteme wie Glucuronidase, Biolumineszens-Marker wie das bakterielle Luciferase-System) erfolgen. Selektive Charakteristika lassen sich dadurch nachweisen, daß bei Selektionsdruck, wie z.B. Antibiotika- oder Herbizideinwirkung oder Angebot einer ungewöhnlichen Nährstoffquelle, nur diejenigen Organismen vermehrungsfähig sind, die das Charakteristikum ausprägen. Organismen, die elektive Eigenschaften ausprägen, geben sich durch ihre besondere Erscheinungsform nach Umsetzung der chromogenen Substrate in ihrer Färbung zu erkennen. Werden Resistenzen gegen Herbizide und Schädlingsbefall (z.B. gegen Viren, Insekten, Nematoden, Pilze) als erwünschte Eigenschaft in Organismen eingeführt, so können diese Eigenschaften für einen phänotypischen Nachweis herangezogen werden.
Veränderungen im Phänotyp sind nur bedingt als Nachweis eines gentechnischen Eingriffs tauglich, da sie auch durch spontane Mutationen und konventionelle Züchtung auftreten können. Zudem sind nicht alle genotypischen Änderungen phänotypisch erkennbar. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, daß die Expression derjenigen Gene, die für die Ausprägung der phänotypischen Veränderung verantwortlich sind, durch Umweltfaktoren beeinflußt wird, d.h. erbgleiche Organismen können sich je nach Umweltbedingungen im Phänotyp unterscheiden. Hinzu kommt, daß bei Mikroorganismen selbst eine deutliche phänotypische Veränderung unter Umständen unerkannt bleibt, da die metabolische und morphologische Variabilität bei einer Vielzahl von Arten nur unvollständig bekannt ist.
Der Nachweis eines gentechnischen Eingriffs anhand phänotypischer
Veränderungen ist deshalb nur in wenigen Fällen und im Prinzip nur
auf der Ebene des gentechnisch veränderten Organismus, und weniger in
einem verarbeiteten Lebensmittel, möglich.
3.4 Nachweis über neu synthetisierte Stoffwechselprodukte
Auch anhand eines neu synthetisierten Stoffwechselproduktes läßt sich in einigen Fällen der Einsatz gentechnischer Verfahren nachweisen. Aufgrund der Vielzahl unterschiedlicher Stoffwechselprodukte kann hierzu kein einheitliches Nachweisverfahren genutzt werden. Je nach Produkt, das analysiert werden soll, ist eine spezifische Nachweismethode zu entwickeln.
Abb. fehlt
CHYMOGEN Kälber-Labenzym
Chymosin aus GVO NATUREN Lab Standard Plus 200
Abb. 1: Vergleich Chymosinpräparaten durch
FPLC-Molekularsiebchromatographie
Eine solche Methode sollte in diesen Fällen möglichst
auf einer frühen Stufe des Lebensmittelverarbeitungsprozesses durchgeführt
werden, da mit zunehmender Verarbeitung die Chancen eines erfolgreichen
Nachweises im allgemeinen sinken. Beispielsweise konnte, aufgrund der
unterschiedlichen Herstellungs- und Aufarbeitungsverfahren fhr
traditionelles Chymosin (ein Enzym, das bei der Käseproduktion zur
Dicklegung der Milch benötigt wird) aus dem Kälbermagen (Lab) und in
gentechnisch veränderten Mikroorganismen produziertes Chymosin, der
Einsatzes gentechnischer Verfahren nachgewiesen werden (Abb. 1). Prokopek [2]
hat den Unterschied zwischen einem Präparat aus konventioneller und einem
solchen aus gentechnischer Produktion anhand der Isoenzyme des Chymosins
beschrieben, während im Staatlichen Lebensmitteluntersuchungsamt
Braunschweig [3] die unterschiedlichen Begleitproteine in den Chymosinpräparaten
für den Nachweis genutzt wurden. Im Käse selbst läßt sich
dagegen die Herkunft des verwendeten Chymosins nicht mehr feststellen.
Neben chemischen und physikalischen Methoden eignen sich vor allem immunologische Verfahren zur Analyse von Stoffwechselprodukten (RIA = Radio-Immuno-Assay, EIA = Enzym-Immuno-Assay, FIA = Fluoreszenz-Immuno-Assay, CIA = Chemolumineszenz-Immuno-Assay). Dabei sind qualitative und quantitative Bestimmungen möglich.
Von den immunologischen Verfahren ist vor allem der Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) geeignet, um den Einsatz gentechnischer Verfahren nachzuweisen. Dabei wird ein Antikörper gegen das nachzuweisende Stoffwechselprodukt adsorptiv an eine Polystyrolmatrix gebunden und anschließend mit einem Gemisch aus Lebensmittelprobe und Enzym-markiertem Stoffwechselprodukt inkubiert. Dabei konkurrieren das Enzym-markierte Stoffwechselprodukt und das Stoffwechselprodukt in der Lebensmittelprobe um die Bindungsstellen am Antikörper. Die quantitative Bestimmung erfolgt über einen nachfolgenden Enzymtest. Es ist auch möglich, den adsorptiv gebundenen Antikörper nur mit der Lebensmittelprobe zu inkubieren, und anschließend einen zweiten enzym-markierten monoklonalen Antikörper gegen das nachzuweisende Stoffwechselprodukt, der gegen eine andere Antikörperbindungsstelle (Epitop) am Stoffwechselprodukt gerichtet ist, einzusetzen (Abb.10; S 65) Auch hierbei erfolgt die quantitative Auswertung über einen Enzymtest (Abb. 2).
Abb.: 2 Immunologisches Testverfahren
Heute lassen sich mit ELISA-Tests bakterielle Endotoxine wie
z.B. das Cry1A(b) Genprodukt nachweisen [4]. Der Nachweis in transgenen
Pflanzen ist aber problematisch, weil Pflanzen für den biologischen
Pflanzenschutz großflächig mit Bacillus thuringiensis-Lösungen
besprüht werden und es sehr schwierig ist, aufgesprühte Toxine von
denjenigen zu unterscheiden, die die gentechnisch veränderten Pflanzen
produzieren. Die Pflanzen müßten deshalb vor der Durchführung
des ELISA-Tests von solchen "externen Toxinen" gereinigt werden.
Ebenso können am Lebensmittel haftende Mikroorganismen z.B. Agrobacterium
zu falsch positiven Ergebnissen führen.
In pflanzlichem Rohmaterial (Sojabohne, Raps, Mais) lassen sich die zu den neueingeführten DNA-Sequenzen korrespondieren Proteine nachweisen. Voraussetzung ist, daß die neueingeführte genetische Information auch exprimiert, d.h. das entsprechende Protein auch synthetisiert wird. Die zur Zeit erhältliche transgene Maisvarietät z.B. enthält drei neu eingeführte Gene. Das Genprodukt des Ampicillin-Resistenzgens wird jedoch in der Pflanze nicht gebildet, das Genprodukt des BT-Gens nur in den grünen Pflanzenteilen und in Pollen. Deshalb werden beide Genprodukte im Mais nicht zu finden sein. In Tierfutter (Sojaschrot, Silo- und Körnermais) kann ein Nachweis auf Proteinebene prinzipiell geführt werden, während von den zur Lebensmittelproduktion eingesetzten Bestandteilen des pflanzlichen Rohmaterials ein Nachweis auf Proteinebene nur in Sojaschrot und den daraus gewonnen Proteinfraktionen möglich sein wird. In Raps- und Sojaöl und in Maisstärke und deren Verzuckerungsprodukten erscheint ein Nachweis auf Proteinebene unmöglich. Dies gilt auch für verarbeitete Lebensmitteln, die solche Bestandteile enthalten.
Auch bei den gegenwärtig in gentechnisch veränderten Mikroorganismen hergestellten Enzymen besteht nur in wenigen Ausnahmefällen eine Nachweismöglichkeit über monoklonale Antikörper, da diese Enzyme im allgemeinen mit den Enzymen aus konventioneller Produktion identisch sind.
Genotypische Veränderungen werden gegenwärtig am
meisten zum Nachweis, daß Lebensmittel mit Hilfe der Gentechnik
hergestellt wurden, genutzt. Das Verfahren stützt sich auf
Nukleotidsequenzen der neueingeführten genetischen Information.
Voraussetzungen hierfür sind, daß die gentechnische Veränderung
bekannt ist (Herstellerfirma, Patent, Datenbanken), daß im Lebensmittel
noch hinreichend intakte rekombinierte Desoxyribonukleinsäure (rDNA)
vorhanden ist, und daß die Modifizierung nicht ausschließlich auf
Verwendung arteigener Gene (Selbstklonierung) beruht, da solche Modifizierung
auch durch ein natürliches Rearrangement von DNA auftreten können.
Als Beispiel einer Selbstklonierung sei die in Großbritannien
zugelassene Backhefe angeführt (Abb.3).
Abb. 3: Schema einer Selbstklonierung
Ein weiteres Problem liegt darin, daß für
Selbstklonierungen keine einheitlichen gesetzlichen Regelungen existieren. Gemäß
der Freisetzungsrichtlinie der Europäische Union ist Selbstklonierung ein
gentechnischer Prozeß. Dies wird jedoch in Ländern wie den USA oder
Japan verneint.
Abb. 4: Schema der Sondentechnik
Im Zusammenhang mit dem Nachweis eine gentechnischen Eingriffs
bei der Produktion von Lebensmitteln lassen sich drei Kategorien von
Rohstoffen, Lebensmitteln und Lebensmittelzutaten unterscheiden:
1. Das Lebensmittel selbst stellt den vermehrungsfähigen, gentechnisch veränderten Organismus dar.
* Tomate, Kürbis, Raps, Mais, Sojabohne, Fisch
2. Das Lebensmittel enthält vermehrungsfähige, gentechnisch veränderte Organismen
* Käse mit Edelschimmel, Joghurt mit Milchsäurebakterien, Biere mit Hefen
3. Das Lebensmittel enthält isolierte oder verarbeitete Produkte aus gentechnisch veränderten Organismen, jedoch nicht den vermehrungsfähigen, gentechnisch veränderten Organismus selbst
* Stärkeprodukte aus transgenem Mais, Käse mit Chymosin aus gentechnisch veränderten Mikroorganismen, Marmelade mit Zucker aus gentechnisch veränderten Zuckerrüben, Tomatenketchup, Kartoffelpüree,
Für die ersten beiden Kategorien wird über die neueingeführte genetische Information ein Nachweis möglich sein, da diese Lebensmittel intakte DNA enthalten, für die dritte Kategorie nur in Ausnahmefällen, je nach Produkt, Verarbeitungstiefe und Gehalt an rekombinierter DNA sowie deren Fragmentlänge.
Nach Abschluß der Fermentation von Lebensmitteln werden Mikroorganismen häufig inaktiviert (z.B. pasteurisierter Joghurt, Sauerkraut) und auch Tiere oder Pflanzen werden als Teil eines zuvor lebenden Organismus verzehrt. Mit dem Eintritt des Todes der Lebewesen findet ein durch Nukleasen katalysierter enzymatischer Abbau der in ihnen enthaltenen DNA statt. Deshalb kann je nach deren Aktivität, der Lager- und Verarbeitungstemperatur, der Lagerzeit und weiterer, aus dem Verarbeitungsprozeß erwachsender Faktoren die DNA soweit abgebaut werden, daß ein genotypischer Nachweis unmöglich oder zumindest stark erschwert wird. Isolierte Produkte lassen sich auch so weit reinigen oder verarbeiten, daß sie keine DNA mehr enthalten (z.B. Zucker aus einer gentechnisch veränderten Zuckerrüben, Zusatzstoffe, Enzyme). Diese Produkte entziehen sich deshalb einem genotypischen Nachweis.
Der Nachweis des Einsatzes gentechnischer Methoden anhand genotypischer Veränderungen setzt nur das Vorliegen neueingeführter DNA-Sequenzen, nicht jedoch eine Genexpression voraus. Der genotypische Nachweis nutzt den Aufbau der DNA. Diese besteht aus zwei komplementären Einzelsträngen, d.h., aus der Basensequenz des einen DNA-Stranges kann die des zweiten abgeleitet werden. Ein genotypischer Nachweis wird u.a. mit spezifischen, synthetischen Oligonukleotiden geführt, die an komplementäre DNA-Sequenzbereiche auf Grund despezifischen Basenpaarung binden. Zur Detektion mittels Hybridisierungstechnik, z.B. Festphasenhybridisierung wie Koloniehybridisierung oder Dot-Blot-Hybridisierung, müssen diese Oligonukleotide mit einem Marker versehen werden (z.B. radioaktives Isotop, Digoxygenin, Fluoreszenzlabel usw.) (Abb. 4). Mit solchen Gensonden lassen sich die gesuchten DNA-Sequenzen und damit auch gentechnisch veränderte Organismen sehr spezifisch nachweisen. In Lebensmitteln, besonders in verarbeiteten, kann die vorhandene DNA-Menge für einen solchen Nachweis zu gering sein, so daß erheblich empfindlichere Nachweismethoden erforderlich sind. Eine derartige Methode steht mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Verfügung, die es erlaubt, mit, spezifischen Primern (synthetische Oligonukleotide), noch Spuren von DNA enzymatisch zu vervielfältigen (Abb. 5, Abb. 6). Synthetische Oligonukleotide (Gensonden, Primer) mit einer zum modifizierten DNA-Bereich komplementären Nukleotidsequenz setzen allerdings voraus, daß die Basensequenz der neueingeführten genetischen Information bekannt ist.
Für einen genotypischen Nachweis können neben
den Nukleotidsequenzen der Zielgene der gewünschten gentechnischen
Modifikation auch die Basensequenzen von Markergenen oder Funktionselementen,
wie Promotoren und Terminatoren, als Zielsequenz dienen. Basiert der Nachweis
auf einem neueingeführten Strukturgen, so müssen im allgemeinen für
jeden gentechnisch veränderten Organismus spezifische Oligonukleotide als
Gensonden bzw. PCR-Primer synthetisiert werden. Da die Anzahl der in der
Gentechnik verwendeten Markergene, Promotoren und Terminatoren noch verhältnismäßig
gering ist, bieten sich deren Sequenzen als Grundlage eines in größerem
Umfang einsetzbaren Nachweisverfahrens (Screeningverfahren) an. Informationen
über die Sequenz des Zielgens sind nicht nötig. Werden Markergene
nach der erfolgreichen gentechnischen Veränderung wieder entfernt, so ist
unter Umständen dennoch ein Nachweis des Einsatzes gentechnischer
Methoden möglich. Als nutzbare Sequenzen dienen die DNA-Bereiche, die benötigt
werden, um solche Markergene wieder aus dem Genom zu entfernen, wie z.B. die
repetierten Basensequenzen von Transposons aus Saccharomyces cerevisiae
[4].
Abb. 5: Primerableitung und Grundprinzip der PCR-Reaktion
Ein positiver Befund, d.h. die gesuchte genotypische Veränderung
liegt vor - wie auch ein negativer, d.h. die gesuchte genotypische Veränderung
liegt nicht vor - kann zu Fehldeutungen führen. Der Nachweis der
Anwesenheit bestimmter Basensequenzen im Genom eines Organismus erlaubt keinen
unmittelbaren Rückschluß auf das Ereignis, das zur Integration
dieser Nukleotidsequenzen in das Erbgut des Organismus geführt hat. Nach
dem Stand der Wissenschaft ist die Möglichkeit eines horizontalen
Gentransfers (artübergreifender Austausch von Erbmaterial nicht
auszuschließen. Deshalb ist der Nachweis des Vorliegens von z.B.
Erbmaterial mikrobiellen Ursprungs wie Antibiotikaresistenzgenen in Pflanzen
nur ein starkes Indiz, jedoch kein Beweis für eine gentechnische Veränderung.
Auch eine Kontamination des Probenmaterials, z.B. mit Mikroorganismen, könnte
für den positive Befund verantwortlich sein. Um das Risiko solcher
Fehldeutungen zu verringern, können Sequenzen aus den Übergangsbereichen
von Strukturgenen, Markergenen und/oder Vektor bzw. von Wirtsgenom und
integrierter Fremd-DNA als Zielbereiche für einen genotypischen Nachweis
herangezogen werden. Auch ein negativer Befund kann Anlaß zu
Fehldeutungen geben; ein negativer Befund stellt lediglich fest, daß die
gesuchte Veränderung auf DNA-Ebene nicht vorliegt, nicht jedoch, daß
im Erbgut des untersuchten Materials überhaupt keine gentechnisch
bedingte Veränderung vorliegt.
Auch RAPD-Typing (random amplified polymorphic DNA) und
RFLP-Analysen (restriction fragment length polymorphism) wurden zum Nachweis
transgener Pflanzen vorgeschlagen [5]. Durch Vergleich der RAPD- bzw.
RFLP-Profile transgener und der entsprechenden nicht transgenen Pflanzen
sollte ein solcher Nachweis möglich sein. Bao et al. [6] haben bei
Reisvarietäten RAPD-Analysen angewandt, um verschiedene neue Kreuzungen
voneinander zu unterscheiden. RAPD-Typing und RFLP-Analysen sind folglich
geeignet, Veränderungen im Genotyp nachzuweisen, ohne jedoch Auskunft darüber
zu geben, auf welchem Wege diese Veränderungen erfolgten.
3.7 Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
Aufgrund ihrer hohen Sensitivität, Spezifität und Schnelligkeit ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) die Methode der Wahl, um die neueingeführte genetische Information nachzuweisen. Die PCR gliedert sich in folgende Schritte (Abb. 6):
1. Thermische Trennung der beiden Stränge eines DNA-Moleküls (Denaturierung),
2. Anlagerung der zur Zielsequenz korrespondierenden Primer an die DNA-Einzelstränge (Annealing),
3. Enzymatische Verlängerung der Primer anhand der Sequenzinformation der DNA-Einzelstränge (Extension), wodurch wieder DNA-Doppelstrangbereich erhalten werden.
Diese Schritte werden 25 - 40mal durchlaufen, dabei wird eine große Anzahl identischer Mole- küle gebildet, die Kopien des zu vervielfältigenden DNA-Bereichs darstellen (Abb.7).
Abb. 6 Temperaturprofil eines PCR-Zyklus
Die Analyse der PCR-Produkte erfolgt im elektrischen Feld
durch Agarose-Gelelektrophorese. Die Spezifität der PCR läßt
sich dadurch erhöhen, daß das PCR-Produkt einer Restriktions- oder
Sequenzierungsanalyse unterworfen wird.
Abb. 7: Schema des PCR-Verfahrens
Eine Spezifitäts- und Sensitivitätserhöhung
kann durch Übertragung des gelelektrophoretisch aufgetrennten
PCR-Ansatzes auf eine Nylonmembran (Southern-Blot) und anschließendes
Sichtbarmachen des PCR-Produktes durch Hybridisierung erreicht werden. Dazu
diente eine spezifische Gensonde, die z.B. mit einem radioaktiven Isotop, mit
Digoxygenin oder mit einem Fluoreszenzlabel markiert ist. Spezifität und
Sensitivität lassen sich auch dadurch erhöhen, daß in einem
zweiten PCR-Ansatz neue Primer verwendet werden, die sich an die
Vermehrungsprodukte des ersten PCR-Ansatzes anlagern (nested PCR, semi-nested
PCR). Zum Nachweis und Identifizierung pathogener Mikroorganismen sowie zur
Qualitätssicherung und -überprüfung wird heute schon die PCR im
Lebensmittelbereich erfolgreich eingesetzt [7-9]. Die Identifizierung
einzelner Lebensmitteln, die mit Hilfe der Gentechnik hergestellt wurden, ist
bereits beschrieben worden [10-18]. Die deutsche Arbeitsgruppe zur Entwicklung
von § 35 LMBG-Verfahren zum Nachweis von mit Hilfe gentechnischer
Verfahren hergestellter Lebensmittel erarbeitete inzwischen eine Methode zur
Identifizierung einer transgenen Kartoffel [19] und von Rohwurst, die mit
gentechnisch veränderten Milchsäurebakterien fermentiert wurde [20];
diese Methoden sind in die amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach
§ 35 LMBG aufgenommen worden. Eine Methode zum Nachweis gentechnisch veränderter
Milchsäurebakterien zur Joghurtfermentation wird gerade in die amtliche
Sammlung aufgenommen. Außerdem ist ein Ringversuch zum Nachweis von
gentechnisch verändertem Soja erfolgreich abgeschlossen worden. Weitere
Arbeiten zum Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel sind in
Vorbereitung (Tab. 1).
|
|
||
| GVO | Status | |
| Kartoffel | § 35 Methode vorhanden; L .24.01 EG-Zulassung geplant | |
| Rohwurst
Starterkultur |
§ 35 LMBG-Methode vorhanden; L 08.0044 | |
| Joghurt
Starterkultur |
Ringversuch abgeschlossen
1. LMBG-Entwurf liegt vor |
|
| Sojabohne | Ringversuch durchgeführt | |
| Tomate | Ringversuch in Vorbereitung | |
| Mais | Methodenerarbeitung | |
| Raps | Methodenerarbeitung | |
Tab. 1: Arbeit der §35 LMBG-Gruppe
Die Schwierigkeit beim Einsatz der PCR als analytischem
Verfahren besteht in der Isolation eines geeigneten DNA-Präparates. Die
DNA muß ausreichend gereinigt sein, da eine Reihe von
Lebensmittelbegleit- und -inhaltsstoffen die PCR schon in sehr geringen
Konzentrationen inhibieren. Dadurch können sich auch Probleme mit der Übertragbarkeit
von DNA-Extraktionsmethoden von einem Lebensmittel zu einem anderen ergeben.
Bisher existieren nur wenige systematische Untersuchungen zur Hemmung der PCR
durch Lebensmittelbegleit- und inhaltsstoffe. Normalerweise enthält ein
Lebensmittel nur wenige Substanzen in Konzentrationen, die die PCR inhibieren.
Durch das eingesetzte DNA-Extraktionsverfahren können einzelne Substanzen
jedoch angereichert werden [20].
Öle, Salze, Kohlenhydrate und Aminosäuren üben in Konzentrationen bis zu 1 % des PCR-Ansatzes keine inhibitorische Wirkung aus. Proteine und Peptide zeigen dagegen einen starken hemmenden Effekt. Die Proteinmenge im PCR-Ansatz sollte deshalb 0,1 % nicht übersteigen. Relativ geringe Mengen Fett verstärken diese hemmende Wirkung. So wird die PCR in Gegenwart von 0,5 % Camemberthomogenat (40 % Fett, 20 % Protein) vollständig unterdrückt.
Außerdem können hohe Konzentrationen von DNA die Empfindlichkeit der PCR beeinträchtigen. Die hemmende Wirkung der Lebensmittelbegleit- und inhaltsstoffe auf die PCR kann auf das Ausfällen der DNA oder auf die Denaturierung bzw. Inhibierung der DNA-Polymerase zurückgeführt werden. Um die Konzentrationen der Lebensmittelbegleit- und -inhaltsstoffe, die die PCR inhibieren, im PCR-Ansatz zu reduzieren, sind entsprechende Extraktions- und Anreicherungsverfahren für die Ziel-DNA zu erarbeiten. Zumeist ist es ausreichend, ein gängiges DNA-Isolationsverfahren an die entsprechende Lebensmittelmatrix zu adaptieren, oder kommerziell erhältliche DNA-bindende Materialien (meist auf Ionenaustauschbasis) zur DNA-Reinigung einzusetzen. Eine besonders elegante Möglichkeit zur Abtrennung störender Begleitstoffe bieten spezifische biotinylierte DNA-Sonden, die über trägergebundenes Avidin fixiert werden. Nur die DNA mit den entsprechenden Zielsequenzen bindet an die DNA-Sonden und kann dann von anderen Lebensmittelbegleit- und -inhaltsstoffen abgetrennt werden.
Außerdem kann die Verarbeitung der Lebensmittel die
Zugänglichkeit einer PCR-fähigen DNA-Präparation negativ
beeinflussen. Während der Lebensmittelverarbeitung kann es zur
Fragmentierung der DNA, z.B. durch mechanische Scherkräfte, durch
enzymatische Prozesse (Nukleasen) und durch chemische Hydrolyse (saurer
pH-Bereich), kommen. Zudem kann die Verarbeitung der Lebensmittel zu einem
vollständigen Abbau oder zur Entfernung der DNA führen (z.B. Zucker
aus gentechnisch veränderten Zuckerrüben).
Grundlegende Verfahrensweise beim genotypischen Nachweis
Lebensmittel, die mit Hilfe der Gentechnik hergestellt wurden, waren zunächst für den Aufbau eines Nachweisverfahrens nicht verfügbar. Daher sollte an Modellsystemen der Nachweis auf DNA-Ebene geführt werden. Ziel der Arbeiten war die Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher Lebensmittelmatrices und der Verarbeitungstiefe des Lebensmittels auf die Isolierbarkeit eines PCR-fähigen DNA-Präparates. Folgende Vorgehensweise wurde gewählt:
1. Isolation der Erbinformation (DNA) aus dem Lebensmittel
2. Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Be- reichs mit Hilfe von spezifischen Primern (Polymerase-Kettenreaktion)
3. Überprhfung der Größe des vervielfältigten DNA-Bereichs im elektrischen Feld (Agarose-Gelelektrophorese)
Die gesuchte Modifikation gilt als nachgewiesen, wenn die
durch Vergleich mit gelelektrophoretisch aufgetrennten Längenstandards
ermittelte Größe des PCR-Produktes der erwarteten Länge der
nachzuweisenden Basensequenz entspricht. Zur Spezifitäts- und Sensitivitätserhöhung
der PCR wurde der gelelektrophoretisch aufgetrennte PCR-Ansatz auf eine
Nylonmembran übertragen (Southern-Blot) und anschließend dort das
PCR-Produkt nach Hybridisierung mit einer spezifischen, Digoxygenin markierten
Gensonde durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht.
Folgende Modellsysteme wurden in die Untersuchungen einbezogen [13, 14, 22]:
1. Das Lebensmittel selbst stellt den gentechnisch veränderten Organismus dar
Da die modifizierte DNA Teil des gentechnisch veränderten Lebensmittels selbst ist, muß die DNA aus dem Gesamtlebensmittel isoliert werden. Als Modell dienten Müsli, Haferflocken und Roggenmehl, denen E. coli Zellen (1010 - 102 cfu/g) bzw. E. coli DNA (10 mg/g - 10 pg/g) zugemischt wurden. Nach Inkubation der Lebensmittelproben in Wasser oder Joghurt (15 min, 25 °C) wurde die DNA aus der gesamten Probe isoliert. Das Untersuchungsmaterial wurde wie folgt aufgearbeitet:
- * Lyophilisieren der Probe
- * DNA-Extraktion aus 400 mg Lyophilisat mit 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1,0 % (w/v) SDS, pH 8,0, 100 mg/ml Proteinase K bei 60 °C für 2 h
- * Phenol/Chloroform/2-Pentanol Extraktion mit 600 ml der wäßrigen Phase
Wird Joghurt als Inkubationsmedium verwendet, ist die Fettschicht vor der Inkubation bei 60 °C zu entfernen.
2. Das Lebensmittel enthält gentechnisch veränderte Organismen
Da die gentechnisch veränderten Organismen einen individuellen Teil eines komplexen Lebensmittels darstellen, ist es möglich, diese Organismen vor der DNA-Extraktion vom Hauptteil des Lebensmittels abzutrennen. Als Modell dienten Müsli, Haferflocken und Roggenmehl, denen E. coli Zellen (1010 - 102 cfu/g) zugemischt wurden. Nach Inkubation der Lebensmittelproben in Wasser oder Joghurt (15 min, 25 °C) wurden die E. coli Zellen vor der DNA-Extraktion durch Zentrifugation vom Hauptteil des Lebensmittels abgetrennt. Das Untersuchungsmaterial wurde wie folgt aufgearbeitet:
- * Homogenisieren der Probe und Zentrifugieren des Homogenats (800 ml)
- * Suspendieren des Pellets in 600 ml 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 % (w/v) Sucrose, pH 8,0, 100 mg/ml Lysozym. Inkubation bei 37 °C für 1 h
- * Zugabe von SDS und Proteinase K (Endkon-zentration: 1 % (w/v) bzw. 100 mg/ml). Inkubation für 30 min bei 60 °C
- * Phenol/Chloroform/2-Pentanol - Extraktion
3. Das Lebensmittel enthält isolierte Produkte aus gentechnisch veränderten Organismen einschließlich rekombinierter DNA
Die modifizierte DNA ist ein individueller Teil eines komplexen Lebensmittels, aber nicht Teil eines Organismus. Deshalb kann die DNA direkt aus der Lebensmittelmatrix ohne Zerstörung von Zellwänden extrahiert werden, d.h. die Abtrennung der DNA vom Hauptteil der Lebensmittelprobe ist möglich. Als Modell dienten Müsli, Haferflocken und Roggenmehl, denen E. coli DNA (1 mg/g - 10 mg/g) zugemischt wurde. Nach Inkubation der Lebensmittelproben in Wasser oder Joghurt (15 min, 25 °C) wurde die E. coli DNA direkt aus der Lebensmittelmatrix extrahiert. Das Untersuchungsmaterial wurde wie folgt aufgearbeitet:
- * Mischen der Probe mit 200 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 2,0 %
(w/v), SDS, pH 8,0, 100 mg/ml Proteinase K (1:1)
- * Zentrifugieren und überführen des Überstands
- * Inkubation bei 60 °C für 30 min
- * Phenol/Chloroform/2-Pentanol/Extraktion mit 600 ml der wäßrigen Phase
Da Müsli und Haferflocken üblicherweise mit Milch oder Joghurt verzehrt werden, wurden die Getreideprodukte vor der DNA-Extraktion eingeweicht. Milch wurde dabei durch Wasser ersetzt, um eine Referenzprobe ohne zusätzliche, die PCR störende Komponenten zu erhalten.
4. Verarbeitete Lebensmittel aus gentechnisch veränderten Organismen
4.1 Sauerteig, Brot
Als Modell diente Roggenmehl, dem E. coli Zellen (1012 - 106 cfu/g) bzw. E. coli DNA (1 mg/g - 10 mg/g) zugemischt wurde. Dieses Roggenmehl wurde sauer fermentiert (12 Stunden bei 30 °C) und nach Hefezusatz verbacken (90 Minuten bei 180 °C).
4.2 Bier: Pils, Export, NutfieldlyteTM (BRF International, Großbritannien)
4.3 Soja`l
4.4 Tomatenprodukte: Ketchup, Mark (Zeneca Plant Sciences, Großbritannien), Suppe, Pizza-, Schältomaten
4.5 Kartoffelprodukte: Pommes frites, Chips, Püree, Mehl, Stärke, Bratkartoffeln
4.6 Enzympäparate: NatuphosR (BASF, Deutschland), NutrilifeTM (Röhm, Deutschland), NovamylTM (Novo Nordisk, Dänemark)
Das Untersuchungsmaterial wurde wie folgt aufgearbeitet:
4.1 Sauerteig, Brot
* Lyophilisieren der Probe
* DNA-Extraktion aus 500 mg Lyophilisat mit 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1,0 % (w/v) SDS, pH 8,0, 100 mg/ml Proteinase K bei 60 °C für 2 h
* Phenol/Chloroform/2-Pentanol Extraktion mit 600 ml der wäßrigen Phase
4.2/4.3 Bier, Soja`l
* 5 ml Bier oder Sojaöl mit 45 ml 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6 versetzen
* Wäßrige Phase auf eine äquilibrierte Qiagen-tip 100 Säule auftragen. Das Waschen und Eluieren erfolgte nach Angaben des Herstellers
* Aufkonzentrieren der DNA durch Ethanolfäl-
lung
4.4/4.5 Pizzatomaten, Schältomaten, Pommes frites, Kartoffelchips, Kartoffelpüree, Kartoffelmehl, Kartoffelstärke, Bratkartoffel, NatuphosR, Tomatenketchup, -mark, -suppe
* Homogenisieren der Probe
* DNA-Extraktion aus 300 mg Lyophilisat mit 100 mM Tris-HCl, 1,0 M NaCl, 20 mM EDTA, 2,0 % (w/v) SDS, pH 8,0, 500 mg/ml Proteinase K bei 60 °C für 1 h
* Phenol/Chloroform/2-Pentanol Extraktion mit 600 ml der wäßrigen Phase und RNase Verdauung.
Tomatenketchup, Tomatenmark und Tomatensuppe wurden vor
dem Homogenisieren lyophilisiert.
4.6 NutrilifeTM, NovamylTM
* DNA-Extraktion aus 50 mg Material mit 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2,0 % (w/v) SDS, pH 7,5, 500 mg/ml Proteinase K bei 55 °C für 30 min
* Phenol/Chloroform/2-Pentanol Extraktion und
Chloroform/2-Pentanol (24:1) Extraktion
Bei den ersten drei Modellsystemen sollte über die
zugesetzte (neueingeführte) genetische Information ein Nachweis möglich
sein, da diese Lebensmittel DNA in ausreichender Fragmentlänge enthalten.
Beim vierten Modell muß die Möglichkeit eines Nachweises von Fall
zu Fall geprüft werden. Die verwendeten PCR-Primer, die
Annealing-Temperaturen in der PCR und die erwartete Größe der
PCR-Produkte sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Bei Zusatz von
E. coli DNA bzw. E. coli Zellen diente ein DNA-Bereich aus dem
Phytase-Gen als Zielsequenz.
| Produkt | Oligonucleotide | Tm °C |
Annealing Temperatur
°C |
erwartete Größe des PCR
Produktes
bp |
| E. coli | GCTAATCGCCTATCTC GGAC
CTAATAACGGGGTGGCGCGG |
|
|
|
| Kartoffel | GTGAGCGTGTTGATGCAACT
GGCCTCAAACGAATAGCAAG |
|
|
|
| Sojabohne | GCCCTATCAACTTTCGATGGTA
ATTTGCGCGCCTGCTGCCT |
|
|
|
| Tomate | GGTTATCCAAAGGAATAGTA
CACCCTTAGCACCAAAGCTA |
|
|
|
| Hefe | GATGGTTTAGGTGACCAATT
GGTCAAGTTCAAACCCTTGT |
|
|
|
| Natuphos | CTCTCGACCCAGGCACCTGC
CGACGGTGCTGGTGGAGATG |
|
|
|
Tab. 2: Verwendete Primer
Liegen keine Inhibitoren im PCR-Ansatz vor, so genügen 10 - 20 Zielmoleküle zur erfolgreichen Vervielfältigung und anschließenden Identifizierung der Zielsequenz. Dies konnte bei Verwendung von gereinigter E. coli DNA und einer reinen E. coli Zellkultur gezeigt werden. Bei Verwendung von komplexen Lebensmittelmatrices als DNA-Quelle stieg die Nachweisgrenze um das 50 bis 100fache an (Agarose-Gelelektrophorese). Anschließendes Southern-Blotting und Hybridisierung mit einer spezifischen Gensonde konnte die Nachweisgrenze um den Faktor 5 - 10 verbessern.
Bei Zusatz von E. coli Zellen ließen sich 103 cfu (Modell 1) bzw. 104 cfu (Modell 2) pro Gramm Lebensmittel noch eindeutig nachweisen. Das entspricht 100 -150 Genkopien im PCR-Ansatz. Die Nachweisgrenze bei Zusatz von E. coli DNA lag bei 10 pg (Modell 1) bzw. 100 pg (Modell 3) pro Gramm Lebensmittel. Das entspricht 150 - 300 Genkopien im PCR-Ansatz. Die scheinbar niedrigere Nachweisgrenze im Modell 1 dürfte auf die höhere DNA-Konzentration in der Lebensmittelmatrix nach der Entfernung des Wassers durch Lyophilisieren zurückzuführen sein. Wird Wasser durch Joghurt als Inkubationsmedium ersetzt, werden die Nachweisgrenzen nicht beeinflußt, falls Milchfett (manuell) und Milchproteine (Proteinase K-Verdau) bei der DNA-Isolierung weitgehend entfernt werden.
Die Untersuchung des Backprozesses zeigte, daß bei
Zusatz von E. coli DNA weder im fermentierten Teig noch im Brot ein
PCR- oder Hybridisierungssignal zu erhalten war. Bei Zusatz von E. coli-Zellen
ließ sich im fermentierten Teig bei mehr als 1010 cfu/g das
Phytase-Gen nachweisen, während im Brot kein Nachweis mehr möglich
war. Dieses Ergebnis könnte auf Schwierigkeiten bei der DNA-Extraktion
aufgrund des DNA-Adsorptionsvermögens des Teiges zurückzuführen
sein. PCR-fähige DNA ließ sich hingegen aus Schältomaten,
Pommes frites, Bratkartoffeln, Kartoffelmehl und Kartoffelchips isolieren, so
daß der Nachweis des Einsatzes der Gentechnik bei diesen Lebensmitteln möglich
ist. Da sich unterschiedliche Pizzatomaten auf dem Markt befinden, ist der
Nachweis des Einsatzes der Gentechnik vom Produkt abhängig. Aus einigen
Pizzatomaten konnte PCR-amplifizierbare DNA isoliert werden, aus anderen
nicht. Verschiedene Biere, Tomatensuppe, Kartoffelstärke, Kartoffelpüree
und Sojaöl entzogen sich dem Nachweis des Einsatzes gentechnischer
Verfahren bei ihrer Herstellung; weder die Agarose-Gelelektrophorese noch die
PCR-Analyse ergaben einen Hinweis auf das Vorliegen von DNA. Daß das
Verfahren in der Lage ist, geringe Mengen an DNA auch in diesen Produkten
spezifisch nachzuweisen, bestätigte sich nach Zugabe von E. coli
DNA zu dem jeweiligen Lebensmittel vor der DNA-Extraktion und PCR-Analyse. Es
gelang, geringe Mengen des Phytasegens aus E. coli in allen
untersuchten Produkten aufzufinden. Die ermittelten Nachweisgrenzen sind in
Tabelle 3 zusammengefaßt.
| Erzeugnis | PCR-Produkt | Nachweisgrenze1 | |
| Bier | nicht erhalten | 100 | |
| Sojaöl | nicht erhalten | 100 | |
| Tomatenketchup
Tomatenmark Pizzatomaten Schältomaten Tomatensuppe |
nicht erhalten
nicht erhalten erhalten erhalten nicht erhalten |
10000
10000 5000 5000 10000 |
|
| Pommes frites
Kartoffelchips Kartoffelpüree Kartoffelmehl (Stärke) Kartoffelmehl Bratkartoffeln |
erhalten
erhalten nicht erhalten nicht erhalten erhalten erhalten |
1000
5000 5000 5000 5000 1000 |
|
| NatuphosR | nicht erhalten | 10000 | |
1bestimmt nach Zugabe von E.coli DNA (Genkopien pro Gramm Lebensmittel)
Tab. 3: PCR-Analyse verarbeiteter Erzeugnisse und
Nachweisgrenzen nach Zusatz von E. coli DNA
Aus NutrilifeTM ließen sich 3,5 - 5 mg DNA
pro Gramm Präparat isolieren. Die Analyse der isolierten DNA in einer
Agarose-Gelelektrophorese zeigte, daß diese DNA stark fragmentiert
vorliegt (< 300 bp). Die PCR-Analyse der isolierten DNA mit
unterschiedlichen Primerpaaren, die DNA-Sequenzbereiche der Übergänge
aus dem ursprünglichen Mikroorganismus und/oder dem Vektor und
Strukturgen des Enzyms abdecken, wurden jeweils PCR-Produkte der erwarteten
Kettenlänge erhalten (Abb. 7). Für dieses Präparat konnte somit
nachgewiesen werden, daß dieses Enzym in einem gentechnisch veränderten
Mikroorganismus produziert wurde.
Außerdem ließ sich mit einem Leguminosen-spezifischen Primerpaar zeigen, daß in NutrilifeTM konventionelles Sojabohnenmehl als Stellmittel verwendet wurde (Abb. 8). Wie Abbildung 9 deutlich macht, sind die verwendeten Nutrilife-Primerpaare spezifisch für die DNA des Produktionsorganismus, denn mit DNA aus Sojabohnen wurde kein PCR-Produkt erhalten.
In NovamylTM ließ sich
gelelektrophoretisch weder DNA nachweisen, noch ergab die PCR-Analyse
Amplifizierungsprodukte. Für dieses Enzymepräparat konnte somit kein
Nachweis geführt werden, daß das Enzym in einem gentechnisch veränderten
Mikroorganismus produziert wurde. Die Untersuchungen wurden noch nicht
systematisch auf eine Vielzahl von Präparaten, die Enzyme aus
gentechnisch veränderten Mikroorganismen enthalten, ausgedehnt. Es ist
jedoch ersichtlich, daß der Nachweis der Herkunft aus einem gentechnisch
veränderten Mikroorganismus nur in Einzelfällen möglich sein
wird.
Abb. fehlt
Abb. 8: PCR-Analyse von NutrilifeTM-DNA mit spezifischen Primern für die gentechnische Veränderung (2%iges Agarosegel)
Bahn 1, 5: DNA-Längenstandard
Bahn 2, 6: NutrilifeTM-DNA
Bahn 3, 7: Sojabohnen-DNA
Bahn 4, 8: Negativkontrolle
Bahn 2 - 4: Nutrilife-Primerpaar: 1/3
Bahn 6 - 8: Nutrilife-Primerpaar 5/6
Abb. fehlt
Abb. 9: PCR-Analyse von NutrilifeTM-DNA mit Leguminosen-spezifischen Primern (2%iges Agarosegel)
Bahn 1, 4, 8: DNA-Längenstandard
Bahn 2: Sojabohnen-DNA Isolation
Bahn 3: NutrilifeTM-DNA Isolation,
Bahn 5: PCR-Analyse der NutrilifeTM-DNA
Bahn 6: PCR-Analyse der Sojabohnen-DNA
Bahn 7: Negativkontrolle
Der Nachweis des Einsatzes gentechnischer Methoden auf DNA-Ebene in pflanzlichem Rohmaterial (Sojabohne, Mais, Raps) wird möglich sein. Auch unter Berücksichtigung des Anteils gentechnisch veränderter Pflanzen am Gesamtanbau (1 - 2 % Sojabohnen, 0,3 % Mais) und der Exportmengen nach Europa wird die Sensitivität der PCR für einen erfolgreichen Nachweis ausreichen. Der größte Teil des Maises und der Sojabohnen wird für Tierfuttermittel verwendet. Da der dazu eingesetzte Silo- und Körnermais keiner Verarbeitung unterliegt, sollte der Nachweis der DNA grundsätzlich möglich sein. Aus Sojabohnen wird lediglich nach Extraktion des Öls der anfallende Sojaschrot als Tierfutter eingesetzt. Trotz dieses Verarbeitungsschrittes sollte der Nachweis der DNA im Sojaschrot möglich sein. Im Lebensmittelbereich werden vor allem verarbeitete Soja-, Raps- und Maisprodukte verwendet. Dabei handelt es sich um Raps- und Sojaöl, sowie Sojalecithin, Sojaprotein und die Verzuckerungsprodukte der Maisstärke (Glucosesirup und Isomerisierungsprodukte, Glucose). In Soja- und Rapsöl kann die DNA mit einigem Aufwand noch nachgewiesen werden. Auch für Sojalecithin ist ein erfolgreicher Nachweis beschrieben worden. Maisstärke dürfte ebenfalls noch genügend DNA für ein erfolgreiches Nachweisverfahren enthalten. In dem aus Sojaschrot gewonnenen Sojaprotein und in den Verzuckerungsprodukten der Maisstärke ist dagegen ein Nachweis auf DNA-Ebene mit großer Wahrscheinlichkeit unmöglich. Das gilt erst recht für Lebensmittel, die solche Produkte enthalten.
Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, wie effektiv die beschriebenen Extraktionsverfahren und die PCR-Analyse sind, um (fremde) DNA in Lebensmittelproben nachzuweisen. Der Nachweis sollte jedoch früh im Herstellungsprozeß geführt werden. Der Zustand des Lebensmittels, d.h. ob das Lebensmittel roh, verarbeitet oder gar in Form eines Fertiggerichtes vorliegt, beeinflußt die Erfolgsaussichten des Nachweisverfahrens. Bei stark verarbeiteten Lebensmitteln oder solchen, die isolierte Produkte aus gentechnisch modifizierten Organismen enthalten, dürfte ein eindeutiger Nachweis des Einsatzes der Gentechnik nur in Ausnahmefällen zu führen sein.
Der Nachweis gelingt auch in Gegenwart großer Mengen an DNA. Möglicherweise verstärken große Mengen DNA das PCR-Signal, indem sie als Carrier für die Ziel-DNA während der DNA-Präzipitation fungierten. Es wurden keine Unterschiede in den Nachweisgrenzen bei Verwendung von Wasser oder Joghurt als Inkubationsmedium gefunden, d.h. auch bei problematischeren Lebensmittelmatrices lassen sich geeignete DNA-Präparationsverfahren erarbeiten. Zumeist ist es ausreichend, ein gängiges DNA-Isolationsverfahren an die entsprechenden Lebensmittelmatrix zu adaptieren oder kommerziell erhältliche DNA-bindende Materialien zur DNA-Reinigung einzusetzen.
Aufgrund der Vielzahl veränderbarer Eigenschaften und
der Vielfalt unterschiedlicher Organismen existiert kein allgemein
einsetzbares einheitliches Nachweisverfahren für die Überprüfung
von Lebensmitteln oder Lebensmittelzutaten auf einen möglichen Einsatz
gentechnischer Methoden. Folglich ist es nicht möglich, eine generelle
Screeningmethode für alle Lebensmittel und Lebensmittelzutaten, die mit
Hilfe der Gentechnik hergestellt wurden, zu entwickeln. Weiterhin ist die
Untersuchung aller Lebensmittel auf eine bestimmte gentechnische Veränderung
mit einem einheitlichen Nachweisverfahren nur bedingt möglich.
Nachweisverfahren sind deshalb nur auf die gezielte Untersuchung einzelner
Lebensmittel auf spezifische gentechnische Veränderungen ausgerichtet.
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